Par la signature du traité de Saint-Germain-en-Laye, l’Angleterre cède l’Acadie à la France. Souhaitant relancer l’entreprise coloniale en Nouvelle-France, le cardinal de Richelieu y nomme un nouveau gouverneur en la personne d’Isaac de Razilly. Accompagné de quelque trois cents hommes, Razilly établit un poste à La Hève, située tout près de l’actuelle ville d’Halifax. Parmi ceux qui accompagnent le sieur de Razilly se trouvent le sieur Charles de Menou d’Aulnay ainsi qu’un entrepreneur originaire de Tours, Nicolas Denys.

Tandis que le sieur d’Aulnay se charge d’établir les colons en Acadie, Nicolas Denys s’occupe des opérations commerciales, implantant d’ailleurs un réseau de postes de traite au sein de sa seigneurie.

Suite à la mort de Razilly, son frère Claude de Razilly hérite de ses possessions en Acadie. Il en confie toutefois l’administration au sieur d’Aulnay qui prend la décision de déménager la colonie acadienne de La Hève à Port-Royal. La disparition du sieur Isaac de Razilly compromet toutefois sa vision du régime seigneurial en Acadie et donne naissance, par le fait même, à une féroce rivalité entre le sieur d’Aulnay et le sieur Charles de Saint-Étienne de La Tour. En effet, l’entente initiale établie entre Claude de La Tour (le père de Charles) et Isaac de Razilly, qui attestait un partage égal des revenus de la traite et le respect des limites seigneuriales, ne fait plus du tout l’affaire de leurs successeurs.

À bord du navire Saint-Jehan arrivent quelques-unes des premières familles françaises qui formeront le noyau du peuplement européen en Acadie au 17^e siècle.

L'Île de Miscou devient l’emplacement d’une mission de missionnaires récollets.

Les conflits opposant les sieurs de La Tour et d’Aulnay s’amplifient davantage lorsque le roi de France, Louis XIII, octroie à chacun d’eux des seigneuries dont les limites se chevauchent. Selon les ordres du roi, d’Aulnay obtiendrait toute la côte Atlantique de la Virginie à la baie de Fundy et La Tour toute la région des Maritimes actuelles sauf la seigneurie de Port-Royal.

La lutte pour le territoire se poursuit entre les sieurs de La Tour et d’Aulnay. En effet, ceux-ci se livrent une bataille incessante. Port-Royal devient justement la cible de l’une de ces attaques, puisque le sieur de La Tour, malgré les ordres du Roi, tente de s’en emparer.

Entre temps, des missionnaires capucins français fondent quatre missions en Acadie, soit à Port-Royal, à La Hève, à Pentagoet et à Canso.

Le sieur de La Tour établit des liens commerciaux avec certains marchands puritains de Boston et est considéré fugitif pour avoir manqué à comparaître devant la Cour de France pour répondre à une série d’accusations. Malgré tout, il commande une autre attaque contre le fort de Port-Royal, siège de l’administration seigneuriale du sieur d’Aulnay. Cette attaque lui permet de s’emparer d’un nombre considérable de fourrures, qu’il partage avec ses alliés bostonnais.

L’épouse du sieur de La Tour, Françoise-Marie Jacquelin, se rend en France plaider la cause de son mari, sous prétexte qu’il était trop malade pour s’y rendre lui-même.

Alors qu’elle a la charge du fort Saint-Jean en l’absence de son époux, Françoise-Marie Jacquelin doit le défendre contre une attaque du sieur d’Aulnay. Ce dernier réussit à saisir le fort et à faire prisonnier ses occupants. Face à cette défaite, le sieur de La Tour se réfugie à Québec. Quelques semaines après l’attaque du fort, Françoise-Marie Jacquelin décède.

La mort accidentelle du sieur d’Aulnay, qui se noie lors d’une randonnée en canot, laisse vacant le poste qu’il occupe dans le gouvernement de l’Acadie. Le sieur de Saint-Étienne de La Tour profite donc du décès de son rival pour effectuer un retour en Acadie et tenter par tout moyen d’accéder, une fois pour toutes, au titre de gouverneur. Il y parvient, mais doit transiger avec un marchand banquier de la Rochelle, Emmanuel Le Borgne, le plus important créancier du sieur d’Aulnay, qui réclame le remboursement des sommes prêtées à ce dernier.

Afin de parer aux prétentions d’Emmanuel Le Borgne et d’unir les deux familles rivales, le sieur Charles de Saint-Étienne de La Tour épouse la veuve du sieur d’Aulnay, Jeanne Motin de Reux. Emmanuel Le Borgne s’empare des établissements érigés par Nicolas Denys. Tous ces conflits internes fragilisent la présence française dans la jeune colonie acadienne.

Une expédition militaire anglaise commandée par Robert Sedgwick s’empare des différents postes français en Acadie dont le principal, Port-Royal. Guillaume Trahan, syndic des habitants de Port Royal, signe l’acte de capitulation au nom des habitants français du lieu.

Avec la signature du traité de Bréda, l’Angleterre restitue l’Acadie à la France. Cependant, l’ancien administrateur de la Nouvelle-Écosse, Sir Thomas Temple, tente de résister à ce changement de régime et veut freiner l’instauration d’un nouveau pouvoir français en Acadie. Temple se résigne finalement à abandonner le territoire qu’il considère sien. Les prétentions anglaises sur l’Acadie/Nouvelle-Écosse ne sont cependant pas complètement oubliées.

Le nouveau gouverneur de l’Acadie, le chevalier Hector d’Andigné de Grandfontaine, est chargé du premier recensement effectué en Acadie. Les résultats de ce recensement dévoilent qu’une soixantaine de familles, soit environ 300 habitants, vivent en Acadie. Ces habitants, très majoritairement, cultivent le sol en utilisant une méthode d’irrigation ingénieuse appelée aboiteaux. L’établissement principal demeure Port-Royal, même si quelques familles habitent dans la région du Cap-Sable et près du fort de Pentagouet.

Jacques Bourgeois, un pionnier de Port-Royal, est à l’origine de l’établissement de Beaubassin dans l’isthme de Chignectou, établissement qui deviendra rapidement l’un des plus considérables en Acadie.

Un corsaire hollandais, Julian Aernoutsz, au service de l’Angleterre, s’empare du fort de Pentagouet.

Le gouverneur général de la Nouvelle-France, le comte de Frontenac, nomme le sieur Michel Leneuf de La Vallière, un officier canadien, administrateur de l’Acadie. L’administration coloniale qui siège à Québec tente de renforcer ainsi les liens entre l’Acadie et le Canada.

Le nouvel établissement des Mines, connu aussi sous le nom de Grand-Pré, se développe sous le leadership des pionniers Pierre Melanson et Pierre Thériot.

Création de la Compagnie de la pêche sédentaire en Acadie, entreprise commerciale française qui souhaite profiter des riches bancs poissonneux au large de l’Acadie. Ses opérations et les pouvoirs juridico-politiques qu’elle reçoit du roi la font entrer en confrontation ouverte avec les pêcheurs de la Nouvelle-Angleterre, certains pêcheurs acadiens et l’administration coloniale de Port-Royal.

Les pressions exercées par la Compagnie de la pêche sédentaire en Acadie réussissent à faire rappeler le gouverneur de l’Acadie, le sieur Michel Leneuf de La Vallière. Il est remplacé par François-Marie Perrot, ancien gouverneur de Montréal et protégé de l’intendant de la Nouvelle-France, Jean Talon. Pas plus que le sieur de La Vallière, Perrot ne pourra freiner la présence des pêcheurs de la Nouvelle-Angleterre dans les eaux acadiennes et s’attirera également les foudres de ses supérieurs métropolitains.

Le développement de la colonie de la baie française suscite l’attention des dirigeants bien au-delà de l’Acadie. Mgr de Saint-Vallier, évêque de Québec, ainsi que Jacques de Meulles, intendant de la Nouvelle-France, viennent constater de leurs propres yeux son essor. Les récits de voyage qu’ils ont laissé constituent une source pertinente qui décrit la réalité acadienne dans le dernier quart du 17^e siècle.

L’Acadie devient une fois de plus victime des hostilités qui sévissent entre la France et l’Angleterre. En effet, sir William Phips dirige une expédition anglaise de quatre cents hommes qui attaque et pille Port-Royal au nom du Massachusetts. Les Acadiens de Port-Royal sont forcés de prêter serment d’allégeance à l’Angleterre. Phips ne laisse pas de garnison anglaise à Port-Royal, mais l’Acadie passe pendant quelques années sous l’influence grandissante du Massachusetts.

Un officier canadien, le sieur Joseph Robinau de Villebon, est nommé commandant de l’Acadie. Il occupe ce poste jusqu’à son décès en 1700 au fort à l’embouchure de la rivière Saint-Jean.

Une nouvelle expédition anglaise contre Port-Royal oblige les chefs de familles de l’endroit à prêter de nouveau serment d’allégeance à la couronne d’Angleterre.

Grâce à la signature du traité de Ryswick, l'Acadie et la baie d'Hudson sont restituées à la France par l’Angleterre.